天然催化劑——酶，對(duì)于維持生命活動(dòng)至關(guān)重要， 比如參與DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。因其具備高效性、專一性和環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，也被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、能源、環(huán)保等多個(gè)領(lǐng)域。但是，天然酶的性質(zhì)往往難以直接滿足工業(yè)應(yīng)用需求，因此，酶工程應(yīng)運(yùn)而生，旨在通過(guò)修飾、優(yōu)化或設(shè)計(jì)酶來(lái)提升其在各種應(yīng)用中的性能。

圖1：主要的酶工程策略

然而，盡管酶工程前景廣闊，但在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)和瓶頸，比如：

1.體外表達(dá)和純化難：由于細(xì)胞膜的存在、內(nèi)部代謝的復(fù)雜性、反應(yīng)條件難以精確控制以及可能的代謝產(chǎn)物毒性，許多需要進(jìn)行工程改造的酶在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)效率低下，且純化過(guò)程困難。

2.大規(guī)模文庫(kù)篩選效率低：定向進(jìn)化需要從龐大的突變體庫(kù)中篩選出具有特定改良性能的酶，傳統(tǒng)的篩選方法無(wú)法高效的從龐大的遺傳多樣性庫(kù)中識(shí)別出最合適的變異；

3.預(yù)測(cè)性設(shè)計(jì)能力有限：由于蛋白質(zhì)序列-功能關(guān)系的復(fù)雜性，精確預(yù)測(cè)突變對(duì)酶性能的影響仍然具有挑戰(zhàn)性。

無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)（CFPS）的出現(xiàn)，為酶工程領(lǐng)域提供了全新的解決方案，重塑了酶工程的研究范式和應(yīng)用前景。該技術(shù)打破了細(xì)胞的“束縛"，無(wú)需維持細(xì)胞活力，大大提高了酶制備的靈活性和效率，從而規(guī)避了上述傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)的諸多限制。

CFPS技術(shù)并非簡(jiǎn)單地將細(xì)胞裂解后提取蛋白，而是一種高度可控、模塊化、開(kāi)放式的體外生物合成平臺(tái)。它通過(guò)保留細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄與翻譯的核心機(jī)器（如核糖體、tRNA、能量再生系統(tǒng)等），在試管或微孔板中直接利用DNA模板合成目標(biāo)蛋白。由于無(wú)需維持細(xì)胞活性，CFPS擺脫了生命系統(tǒng)的諸多約束，為酶的設(shè)計(jì)、篩選與優(yōu)化提供了未有的自由度。其優(yōu)勢(shì)包括：

1.開(kāi)放反應(yīng)體系；2.操作簡(jiǎn)便靈活；3.表達(dá)快速高效易純化；4.可與自動(dòng)化設(shè)備結(jié)合等。

圖2：無(wú)細(xì)胞酶工程示意圖

• 高通量篩選與定向進(jìn)化

• 毒性酶的高效表達(dá)

傳統(tǒng)酶工程中，毒性酶的表達(dá)是一大難題，因?yàn)檫@些酶會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性甚至致死效應(yīng)，導(dǎo)致無(wú)法獲得足夠產(chǎn)量。CFPS技術(shù)因無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可安全表達(dá)此類(lèi)“危險(xiǎn)"蛋白。

• 加速酶設(shè)計(jì)與優(yōu)化

• 非天然酶設(shè)計(jì)

• 多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的構(gòu)建

CFPS技術(shù)通過(guò)縮短反應(yīng)時(shí)間和加速代謝途徑優(yōu)化，可以很容易地?cái)U(kuò)展為無(wú)細(xì)胞代謝工程（CFME）的多路復(fù)用形式。與體內(nèi)系統(tǒng)相比，CFME具有反應(yīng)速率更快、對(duì)底物和產(chǎn)物耐受性更高以及易于分離產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)允許科研人員構(gòu)建多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將各種酶通過(guò)物理或功能連接聚集在一起，形成復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)，合成高附加值生物產(chǎn)品。

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圖3：采用純化酶(a)或細(xì)胞提取物(b)進(jìn)行的無(wú)細(xì)胞代謝工程

酶工程是連接基礎(chǔ)生物學(xué)與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的橋梁，而無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)正在重塑酶工程的研究范式，其開(kāi)放性、靈活性和高效性為解決傳統(tǒng)酶工程面臨的挑戰(zhàn)提供了全新解決方案。從難表達(dá)酶的高效合成，到翻譯后修飾的精準(zhǔn)調(diào)控，再到代謝途徑的理性設(shè)計(jì)和非天然酶的功能拓展，這項(xiàng)技術(shù)展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

未來(lái)，CFPS有望與AI驅(qū)動(dòng)的酶設(shè)計(jì)、自動(dòng)化機(jī)器人平臺(tái)深度融合，構(gòu)建“設(shè)計(jì)—合成—測(cè)試—學(xué)習(xí)"（Design-Build-Test-Learn）閉環(huán)，極大加速新型工業(yè)酶的開(kāi)發(fā)進(jìn)程。隨著技術(shù)的不斷成熟，CFPS技術(shù)有望在以下領(lǐng)域發(fā)揮更大作用：

CFPS技術(shù)或?qū)⒅厮苷麄€(gè)生物制造生態(tài)，推動(dòng)生物制造、醫(yī)藥開(kāi)發(fā)、環(huán)境治理等領(lǐng)域的創(chuàng)新發(fā)展。未來(lái)，我們有理由期待這一技術(shù)為綠色生物制造和可持續(xù)發(fā)展貢獻(xiàn)更多力量，開(kāi)啟酶工程研究的新篇章。

珀羅汀生物作為一家專業(yè)的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)生物技術(shù)公司，已依托自主研發(fā)的 CFPS 技術(shù)平臺(tái)，搭建起高通量自動(dòng)化蛋白表達(dá)工作站，可高效完成難表達(dá)酶、膜蛋白等的快速合成，助力酶開(kāi)發(fā)、藥物靶點(diǎn)研究等場(chǎng)景的效率升級(jí)。