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無細(xì)胞蛋白表達(dá):突破傳統(tǒng)瓶頸,解鎖3大高難度蛋白應(yīng)用場景

更新時(shí)間:2025-07-25      點(diǎn)擊次數(shù):488

膜蛋白結(jié)構(gòu)解析卡在表達(dá)階段?

非天然氨基酸標(biāo)記總失敗?

蛋白表達(dá)通量太低?

毒蛋白無法表達(dá)?

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)正在顛蛋白生產(chǎn)困境,為科研與產(chǎn)業(yè)帶來全新可能。


一、技術(shù)革新:無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)


無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成 (CFPS) 系統(tǒng)是一項(xiàng)創(chuàng)新技術(shù),具有廣泛的潛在應(yīng)用。在基礎(chǔ)科學(xué)和應(yīng)用科學(xué)中,CFPS系統(tǒng)是分子生物學(xué)家的重要媒介。與活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)相比,它具有許多優(yōu)勢,并且更頻繁地用于高通量功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)。在創(chuàng)建核酸可編程蛋白陣列 (NAPPA) 等蛋白質(zhì)陣列或使用顯示技術(shù)創(chuàng)建工程酶時(shí),CFPS 系統(tǒng)非常重要。連接基因型和表型 (表達(dá)蛋白的功能) 的主要方法是通過無細(xì)胞法。此外,CFPS 系統(tǒng)對于有毒、膜結(jié)合、病毒性且易受細(xì)胞內(nèi)蛋白酶介導(dǎo)的快速蛋白水解破壞的蛋白質(zhì)的表達(dá)至關(guān)重要。下面將從幾個(gè)方面對比CFPS和傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)形式。


無細(xì)胞蛋白表達(dá):突破傳統(tǒng)瓶頸,解鎖3大高難度蛋白應(yīng)用場景


圖1:反應(yīng)所需的無細(xì)胞蛋白合成 (CFPS) 系統(tǒng)組分的圖示


1.表達(dá)階段對比

無細(xì)胞蛋白表達(dá):突破傳統(tǒng)瓶頸,解鎖3大高難度蛋白應(yīng)用場景

2.下游處理對比

無細(xì)胞蛋白表達(dá):突破傳統(tǒng)瓶頸,解鎖3大高難度蛋白應(yīng)用場景



二、核心應(yīng)用場景與案例




場景1:全長跨膜蛋白生產(chǎn)——藥物靶點(diǎn)開發(fā)的"鑰匙"


跨膜蛋白 (TMP) 位于不同的膜中,它們在細(xì)胞或細(xì)胞器的內(nèi)側(cè)和外側(cè)之間提供門。人類蛋白質(zhì)組中大約 25% 的編碼蛋白包含一個(gè)或多個(gè)膜區(qū)域。全長跨膜蛋白作為細(xì)胞信號傳遞和物質(zhì)交換的核心載體,是目前最主要的藥物靶點(diǎn),占現(xiàn)階段已知藥物靶點(diǎn)的60%以上。然而,全長膜蛋白難溶于水、易聚集失活,是蛋白表達(dá)中的難點(diǎn)。基于細(xì)胞表達(dá)往往效果不好;采用如VLP等方法時(shí)雖然能得到全長膜蛋白,但是不相干雜蛋白干擾過大;采用膜蛋白胞外區(qū)截?cái)嗟姆椒ㄔ诘鞍仔阅苌系娘L(fēng)險(xiǎn)有較大隱憂。而無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù),則可以高成功率、高純度、高活性的表達(dá)全長膜蛋白。


珀羅汀生物案例:全長CLDN 18.1膜蛋白可溶表達(dá)


實(shí)驗(yàn)人員構(gòu)建了融合標(biāo)簽的CLDN 18.1質(zhì)粒,選用合適的珀羅汀無細(xì)胞表達(dá)條件體系,進(jìn)行表達(dá)。通過在無細(xì)胞反應(yīng)體系中加入表面活性劑,實(shí)現(xiàn)CLDN 18.1的可溶表達(dá)。經(jīng)純化,成功獲得80%以上純度的CLDN 18.1蛋白。下游活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,CLDN 18.1蛋白具有良好的生物學(xué)活性!

(詳情鏈接:明星膜蛋白CLDN 18.1新合成路線:無細(xì)胞系統(tǒng)全長蛋白表達(dá)

此外我司基于自主知識產(chǎn)權(quán)的無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù),已成功表達(dá)多種單次、四次、七次全長跨膜蛋白,表達(dá)成功率接近100%!




場景2:難度蛋白表達(dá)生產(chǎn)—突破蛋白結(jié)構(gòu)研究的“限制"

某些蛋白質(zhì)因其特殊的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì),被歸為難表達(dá)蛋白,它們不僅是基礎(chǔ)科學(xué)的重要課題,更是藥物開發(fā)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物制造的瓶頸問題。在傳統(tǒng)表達(dá)體系中難表達(dá)蛋白往往面臨產(chǎn)量低、活性差等問題,它們的表達(dá)障礙主要源于三個(gè)層面的限制:

1.分子層面,如含有密集二硫鍵網(wǎng)絡(luò)或復(fù)雜四級結(jié)構(gòu)的蛋白(如抗體Fab片段、多亞基酶復(fù)合體),極易在折疊過程中發(fā)生構(gòu)象錯(cuò)誤,形成無活性的包涵體;

2.細(xì)胞層面,疏水性強(qiáng)的跨膜蛋白或依賴特定糖基化修飾的功能蛋白(如GPCRs、凝血因子Ⅶ),難以在普通宿主細(xì)胞中維持其天然構(gòu)象;

3.生理層面,具有細(xì)胞毒性的蛋白(如溶菌酶)會直接干擾宿主細(xì)胞的正常代謝,造成表達(dá)系統(tǒng)崩潰。此外,培養(yǎng)環(huán)境的細(xì)微變化(如氧化還原電位波動(dòng)、分子伴侶缺失)都可能引發(fā)蛋白的錯(cuò)誤加工或降解,進(jìn)一步降低表達(dá)成功率。


珀羅汀生物案例:毒蛋白生產(chǎn)


依托PLD無細(xì)胞快速表達(dá)技術(shù),成功表達(dá)出BamHI限制性內(nèi)切酶。通過在質(zhì)粒中加入PLD無細(xì)胞蛋白表達(dá)的BamHI限制性內(nèi)切酶,濃度分別為0、0.001、0.0015、0.015、0.15 ug/uL,37℃酶切1h,驗(yàn)證酶活性。實(shí)驗(yàn)證明PLD無細(xì)胞蛋白表達(dá)的BamHI限制性內(nèi)切酶具有活性,低濃度為 0.001 ug/uL即可顯示酶切活性。

詳情鏈接:無細(xì)胞蛋白表達(dá)——難度蛋白表達(dá)“急救包"


此外,我司無細(xì)胞蛋白表達(dá)平臺已成功用于合成各種分子量的蛋白質(zhì),從單結(jié)構(gòu)域到多結(jié)構(gòu)域、單個(gè)亞基到多亞基蛋白復(fù)合體,分子量從10 kDa到160 kDa,PLD無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)都能勝任,并得到活性驗(yàn)證。



場景3:高通量篩選——抗體優(yōu)化的"全自動(dòng)工廠"

在抗體藥物研發(fā)中,高通量篩選(HTS)已成為縮短開發(fā)周期、提升抗體性能的核心技術(shù)。然而,傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的局限性,使得這一過程仍面臨效率與成本的博弈。比如現(xiàn)代抗體工程(如噬菌體展示、單B細(xì)胞測序)可生成數(shù)百萬種候選序列,但傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)僅能逐批測試,耗時(shí)數(shù)月。抗體需同時(shí)滿足親和力、穩(wěn)定性、可溶性、低免疫原性等要求,傳統(tǒng)方法需分步測試。


珀羅汀生物案例:打造高通量無細(xì)胞蛋白表達(dá)工作站


我司打造的高通量無細(xì)胞蛋白表達(dá)工作站,實(shí)現(xiàn)抗體篩選技術(shù)的革命性突破!該平臺具備三大優(yōu)勢:


超高通量篩選能力:每日可完成3000個(gè)抗體的自動(dòng)化篩選,將傳統(tǒng)以周/月為單位的篩選周期壓縮至24小時(shí)內(nèi),真正實(shí)現(xiàn)"今日設(shè)計(jì)-明日驗(yàn)證"的研發(fā)新范式。

全流程無人化操作:從DNA模板到功能抗體的全自動(dòng)合成系統(tǒng),支持線性化DNA片段直接表達(dá),數(shù)小時(shí)內(nèi)表達(dá)候選抗體,全程無需人工干預(yù)和純化步驟。

全抗體類型兼容:突破性解決二硫鍵正確配對難題,可高效表達(dá)從VHH、scFv等小分子片段到Fab、全長抗體的所有類型。


詳情鏈接:抗體篩選“天選"模式,日篩抗體三千個(gè)


結(jié)語


在生命科學(xué)研究和藥物開發(fā)中,蛋白表達(dá)技術(shù)始終是突破創(chuàng)新的核心驅(qū)動(dòng)力。無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)以其快速、靈活、高效的優(yōu)勢,正在重塑傳統(tǒng)蛋白研究的邊界——無論是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的全長膜蛋白、傳統(tǒng)系統(tǒng)難以駕馭的高難度蛋白,還是需要精準(zhǔn)修飾的非天然氨基酸插入蛋白,都能通過這一技術(shù)獲得突破性進(jìn)展。



參考文獻(xiàn)

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