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膜蛋白結構解析卡在表達階段？
非天然氨基酸標記總失敗？
蛋白表達通量太低？
毒蛋白無法表達？
無細胞蛋白表達技術正在顛蛋白生產困境，為科研與產業帶來全新可能。
一、技術革新：無細胞蛋白表達技術
無細胞蛋白質合成 （CFPS） 系統是一項創新技術，具有廣泛的潛在應用。在基礎科學和應用科學中，CFPS系統是分子生物學家的重要媒介。與活細胞中的蛋白質表達相比，它具有許多優勢，并且更頻繁地用于高通量功能基因組學和蛋白質組學。在創建核酸可編程蛋白陣列 （NAPPA） 等蛋白質陣列或使用顯示技術創建工程酶時，CFPS 系統非常重要。連接基因型和表型 （表達蛋白的功能） 的主要方法是通過無細胞法。此外，CFPS 系統對于有毒、膜結合、病毒性且易受細胞內蛋白酶介導的快速蛋白水解破壞的蛋白質的表達至關重要。下面將從幾個方面對比CFPS和傳統細胞表達形式。
圖1:反應所需的無細胞蛋白合成 （CFPS） 系統組分的圖示
1.表達階段對比
2.下游處理對比
二、核心應用場景與案例
場景1：全長跨膜蛋白生產——藥物靶點開發的"鑰匙"
跨膜蛋白 （TMP） 位于不同的膜中，它們在細胞或細胞器的內側和外側之間提供門。人類蛋白質組中大約 25% 的編碼蛋白包含一個或多個膜區域。全長跨膜蛋白作為細胞信號傳遞和物質交換的核心載體，是目前最主要的藥物靶點，占現階段已知藥物靶點的60%以上。然而，全長膜蛋白難溶于水、易聚集失活，是蛋白表達中的難點。基于細胞表達往往效果不好；采用如VLP等方法時雖然能得到全長膜蛋白，但是不相干雜蛋白干擾過大；采用膜蛋白胞外區截斷的方法在蛋白性能上的風險有較大隱憂。而無細胞蛋白表達技術，則可以高成功率、高純度、高活性的表達全長膜蛋白。
珀羅汀生物案例：全長CLDN 18.1膜蛋白可溶表達
實驗人員構建了融合標簽的CLDN 18.1質粒，選用合適的珀羅汀無細胞表達條件體系，進行表達。通過在無細胞反應體系中加入表面活性劑，實現CLDN 18.1的可溶表達。經純化，成功獲得80%以上純度的CLDN 18.1蛋白。下游活性驗證實驗表明，CLDN 18.1蛋白具有良好的生物學活性！
（詳情鏈接：明星膜蛋白CLDN 18.1新合成路線：無細胞系統全長蛋白表達
此外我司基于自主知識產權的無細胞蛋白表達技術，已成功表達多種單次、四次、七次全長跨膜蛋白，表達成功率接近100%！
場景2：難度蛋白表達生產—突破蛋白結構研究的“限制"
某些蛋白質因其特殊的結構特征和理化性質，被歸為難表達蛋白，它們不僅是基礎科學的重要課題，更是藥物開發、結構生物學和生物制造的瓶頸問題。在傳統表達體系中難表達蛋白往往面臨產量低、活性差等問題，它們的表達障礙主要源于三個層面的限制：
1.分子層面，如含有密集二硫鍵網絡或復雜四級結構的蛋白（如抗體Fab片段、多亞基酶復合體），極易在折疊過程中發生構象錯誤，形成無活性的包涵體；
2.細胞層面，疏水性強的跨膜蛋白或依賴特定糖基化修飾的功能蛋白（如GPCRs、凝血因子Ⅶ），難以在普通宿主細胞中維持其天然構象；
3.生理層面，具有細胞毒性的蛋白（如溶菌酶）會直接干擾宿主細胞的正常代謝，造成表達系統崩潰。此外，培養環境的細微變化（如氧化還原電位波動、分子伴侶缺失）都可能引發蛋白的錯誤加工或降解，進一步降低表達成功率。
珀羅汀生物案例：毒蛋白生產
依托PLD無細胞快速表達技術，成功表達出BamHI限制性內切酶。通過在質粒中加入PLD無細胞蛋白表達的BamHI限制性內切酶，濃度分別為0、0.001、0.0015、0.015、0.15 ug/uL，37℃酶切1h，驗證酶活性。實驗證明PLD無細胞蛋白表達的BamHI限制性內切酶具有活性，低濃度為 0.001 ug/uL即可顯示酶切活性。
詳情鏈接：無細胞蛋白表達——難度蛋白表達“急救包"
此外，我司無細胞蛋白表達平臺已成功用于合成各種分子量的蛋白質，從單結構域到多結構域、單個亞基到多亞基蛋白復合體，分子量從10 kDa到160 kDa，PLD無細胞蛋白表達系統都能勝任，并得到活性驗證。
場景3：高通量篩選——抗體優化的"全自動工廠"
在抗體藥物研發中，高通量篩選（HTS）已成為縮短開發周期、提升抗體性能的核心技術。然而，傳統細胞表達系統的局限性，使得這一過程仍面臨效率與成本的博弈。比如現代抗體工程（如噬菌體展示、單B細胞測序）可生成數百萬種候選序列，但傳統細胞表達僅能逐批測試，耗時數月。抗體需同時滿足親和力、穩定性、可溶性、低免疫原性等要求，傳統方法需分步測試。
珀羅汀生物案例：打造高通量無細胞蛋白表達工作站
我司打造的高通量無細胞蛋白表達工作站，實現抗體篩選技術的革命性突破！該平臺具備三大優勢：
超高通量篩選能力：每日可完成3000個抗體的自動化篩選，將傳統以周/月為單位的篩選周期壓縮至24小時內，真正實現"今日設計-明日驗證"的研發新范式。
全流程無人化操作：從DNA模板到功能抗體的全自動合成系統，支持線性化DNA片段直接表達，數小時內表達候選抗體，全程無需人工干預和純化步驟。
全抗體類型兼容：突破性解決二硫鍵正確配對難題，可高效表達從VHH、scFv等小分子片段到Fab、全長抗體的所有類型。
詳情鏈接：抗體篩選“天選"模式，日篩抗體三千個
結語
在生命科學研究和藥物開發中，蛋白表達技術始終是突破創新的核心驅動力。無細胞蛋白表達技術以其快速、靈活、高效的優勢，正在重塑傳統蛋白研究的邊界——無論是結構復雜的全長膜蛋白、傳統系統難以駕馭的高難度蛋白，還是需要精準修飾的非天然氨基酸插入蛋白，都能通過這一技術獲得突破性進展。
參考文獻
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2.Dobson L, Tusnády GE. MemDis: Predicting Disordered Regions in Transmembrane Proteins. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12270. Published 2021 Nov 12. doi:10.3390/ijms222212270.
3.Chen JP, Gong JS, Su C, Li H, Xu ZH, Shi JS. Improving the soluble expression of difficult-to-express proteins in prokaryotic expression system via protein engineering and synthetic biology strategies [published online ahead of print, 2023 May 25]. Metab Eng. 2023;78:99-114. doi:10.1016/j.ymben.2023.05.007.
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