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生物體內的蛋白質結構基礎是由自然界中存在的20種氨基酸構建而成的，然而，隨著現代科技的飛速發展，醫療、食品科學及材料工程等領域對蛋白質性能的需求日益多元化和復雜化，這些天然蛋白質已難以滿足這些多樣化的應用需求。而非天然氨基酸（uAAs）及其參與合成的蛋白質逐漸展現出性能與潛力，探索利用非天然氨基酸對蛋白質進行改造的技術，正逐步成為科研領域中的一個研究熱點。
uAAs作為人工合成的氨基酸衍生物，其化學性質和生物活性為蛋白質工程提供了無限可能。利用終止密碼子在蛋白質中插入uAAs，可以廣泛拓展蛋白質的結構和功能,增加蛋白質的新興應用。但在傳統的基于細胞的蛋白翻譯系統中,翻譯終止因子會和非uAAs競爭終止密碼子位點，造成翻譯的提前終止以及uAAs的低效表達。而且這些競爭因子大部分都是維持細胞存活的必需蛋白,無法在細胞內直接去除。而無細胞蛋白表達技術（CFPS）則憑借其優勢和無限潛力，不僅為uAAs的表達和應用開辟了一片廣闊的天地，也為蛋白質工程、藥物研發、基礎科學研究等領域注入了新的活力。
圖1：目前已知的非天然氨基酸生物體合成途徑
1.應用前景
藥物研發與應用：傳統醫藥的開發主要通過篩選現有的化合物庫,但很多蛋白質藥物很難通過化學合成來獲得,缺乏對蛋白質藥物的設計和改造。uAAs有著特殊的化學基團,這些基團可以給蛋白類藥物帶來新的空間結構,顯著拓展蛋白藥物的設計空間。常規藥物主要由天然氨基酸通過非共價相互作用發揮療效,具有結合不夠穩定、容易解離而導致藥效不理想的局限性,相比之下共價蛋白藥物有著更大的治療潛力。
圖2：PD-L1共價藥物開發原理
蛋白質工程和生物醫學研究：uAAs可以用來探索蛋白質的結構和功能關系，揭示蛋白質的作用機制，并為蛋白質藥物的設計和優化提供重要依據。通過在蛋白質中引入uAAs，可以實現對其結構和功能的精確調控，從而創造出具有全新功能的蛋白質分子。
材料科學：uAAs還具有良好的物理和化學性質，可用于合成高分子材料。這些材料在工業生產和日常生活中具有廣泛應用，如塑料、橡膠和纖維等。通過引入uAAs可以賦予這些材料新的性能特性，如增強耐熱性、耐腐蝕性和耐候性等。
2.局限性
合成成本高：uAAs主要通過化學合成法生產。這種方法存在反應步驟復雜、生產成本高以及對映體選擇性差等缺點，限制了uAAs的規模化生產。
技術困難：在蛋白質工程中引入uAAs需要解決一系列技術挑戰，如遺傳密碼擴展、tRNA/氨酰-tRNA合成酶對的優化等。這些技術難題限制了uAAs在蛋白質工程中的廣泛應用。
表達量低：傳統的細胞內表達存在很多問題，比如細胞毒性、競爭關系等等都會造成uAAs的低效表達。
無細胞非天然蛋白質合成系統，作為細胞內合成途徑的有效輔助工具，極大地拓寬了蛋白質結構與功能的邊界，已在蛋白質科學的基礎研究與工業生產中展現出其價值。該系統摒棄了對完整活細胞的依賴，轉而利用細胞提取物作為起點，通過補充能量來源及多樣化的輔助因子，有效跨越了細胞膜的界限，為系統設計與過程控制的精細化提供了未有的靈活性。
圖 ：無細胞非天然蛋白質合成體系
此外，該系統能夠整合功能性uAAs，不僅優化了蛋白質的既有特性，還創新性地賦予它們全新的結構與功能維度。目前，在無細胞非天然蛋白質合成領域內，uAAs的引入策略可大致劃分為兩大類別：一類是基于天然翻譯機制的全面抑制策略，另一類則涵蓋了正交翻譯體系下的終止密碼子抑制、移碼抑制、有義密碼子再分配以及利用非天然堿基對等方法，這些策略共同促進了非天然蛋白質合成的多樣性和高效性。CFPS技術在uAAs應用中的主要優勢包含以下幾個：
1.高效性與精確性
CFPS系統能夠在短時間內完成大量蛋白質的合成，且通過優化反應條件，可以實現對uAAs插入位置和數量的精確控制。這種高效性與精確性的結合，使得研究人員能夠更加快速地獲得高質量的蛋白質產物，加速科學研究的進程。
2.靈活性與可定制性
與傳統的細胞系統相比，CFPS系統具有更高的靈活性和可定制性。研究人員可以根據需要調整反應體系中的成分和條件，來適應不同uAAs和蛋白質的需求。這種個性化的優化策略不僅提高了合成效率，還保證了產物的純度和活性。
3.快速響應與可擴展性
CFPS技術可以快速響應科研需求，并且可擴展性強。通過調整反應規模和條件，可以靈活應對不同規模的生產需求，滿足從實驗室研究到工業生產的多樣化需求。
4.成本低
由于CFPS反應環境的開放性和可訪問性，Prashanta Shrestha等人通過使用替代能源，將uAAs納入CFPS的成本降低了55%。此外，無細胞系統允許直接使用線性表達模板的PCR產品，減少了繁瑣的質粒庫制備步驟。因此無論是在時間上還是金錢上的成本都會顯著降低。
圖 ：體內表達、基于質粒的CFPS和基于LET的CFPS的勞動力投資比較
相比于傳統基于細胞的蛋白表達系統，CFPS技術有著明顯的優勢。此外，隨著生物科技的不斷發展和進步，CFPS技術在uAAs應用上的前景將更加廣闊。
表1：無細胞及細胞非天然蛋白質合成體系比較
珀羅汀生物依托自主研發的CFPS技術已成功表達多個定點插入非天然氨基酸的候選抗體分子！
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