“一鍵合成”｜從DNA到膜蛋白

更新時間：2024-12-06 點擊次數：988

膜蛋白在細胞表面的特定位置具有特定功能，其在生理功能（比如說營養吸收、信號轉導、有毒物質的去除等等）和病理過程（如癌癥發展、病原體入侵等等）中發揮著重要作用，也是理想的藥物靶點。膜蛋白表達在生物學和醫學領域具有極其重要的地位，但同時也面臨著諸多挑戰和瓶頸。

一、膜蛋白表達的重要性及瓶頸

1. 重要性

1.1物質運輸與信號傳導：膜蛋白作為細胞膜的主要成分，負責物質的跨膜運輸和細胞內外信號的傳導。

1.2細胞識別與免疫應答：膜蛋白還參與細胞的識別過程，作為細胞表面的標志物，能夠與其他細胞或分子相互作用。

1.3藥物靶點與疾病治療：膜蛋白承擔了生物膜的主要功能,是新藥研發最重要的靶點群,大約60%的藥物以膜蛋白為靶點。

2.瓶頸

2.1表達效率低：由于膜蛋白復雜的結構和疏水性，使得它們在細胞內的表達往往受多種因素的限制，從而導致表達效率低下。

2.2純化困難：膜蛋白與細胞膜緊密結合，難以通過傳統的蛋白質純化方法獲得高純度的目標蛋白。

2.3穩定性差：由于膜蛋白在水溶液中有明顯的聚集和變性傾向,在體外很難模擬維持膜蛋白正確構象的類膜環境,導致膜蛋白的結構和功能以及相關配體藥物的研究遠遠滯后于水溶性蛋白。

2.4功能驗證困難：由于膜蛋白的功能往往與其在細胞膜上的定位和相互作用密切相關，傳統的驗證手段很難在體外準確地驗證其功能。

圖1.膜蛋白在生物體內合成途徑

綜上所述，膜蛋白表達在生物學和醫學領域具有不可替代的作用，但同時也面臨著諸多挑戰和瓶頸。為了克服這些困難，研究者們正在不斷探索新的表達系統和純化方法，以期提高膜蛋白的表達效率和純度，為疾病治療和藥物研發提供更有力的支持。其中，無細胞蛋白表達技術（Cell-Free Protein Synthesis, CFPS）因其優勢，在膜蛋白表達領域展現出巨大的潛力。

二、CFPS技術在膜蛋白表達上的應用

2.1 概述

CFPS技術是一種在體外實現DNA到蛋白質轉錄翻譯過程的技術。它利用來源于細胞的轉錄翻譯元件，在體外構建能夠直接從DNA合成蛋白質的反應體系。這種技術擺脫了細胞的束縛，具有快速、靈活、可控和易于優化的特點。

在膜蛋白表達中，CFPS技術能夠顯著提高表達效率，通過優化反應條件和添加特殊配置的輔助分子試劑，實現膜蛋白的高效合成。同時，由于無細胞體系不含有復雜的細胞成分，因此可以簡化膜蛋白的純化過程，提高純度和回收率。此外，無細胞體系還能夠提供適宜的反應條件，如溫度、pH值和離子強度等，有助于維持膜蛋白的天然構象和穩定性。更重要的是，CFPS技術為膜蛋白的功能驗證提供了有力支持。通過構建細胞膜模型，利用脂質體或合成細胞膜模擬細胞膜環境，研究者可以在體外觀察膜蛋白的活性、轉運速率和信號傳導能力等，從而驗證其功能。這種方法不僅避免了細胞內復雜環境的干擾，還提高了功能驗證的準確性和可靠性。

2.2 應用場景

生產嗅覺受體蛋白

嗅覺受體蛋白是一類典型的膜蛋白,屬于G蛋白偶聯受體家族，可以直接識別氣味分子,將生物信號轉化為電信號，最終傳遞至神經中樞，調控著生物的食物尋找、危險趨避和求偶行為。但是傳統的膜蛋白獲取方法并不容易。天然組織中的膜蛋白含量太低不足以支撐學術研究。李劍勇等人選取Canton-S果蠅的嗅覺受體蛋白OR83b、OR7a和OR42a作為研究對象，探索用于膜蛋白表達的無細胞表達體系.成功表達出嗅覺受體蛋白質OR83b、OR7a和OR42a，最高表達量達到313 mg/L，實現了膜蛋白的高效表達。

圖2：OR83b和OR42a的可溶性表達

制備病毒體

siRNA治療應用的困難在于缺乏安全有效的輸送載體，而病毒體作為一種由脂質膜和膜蛋白組成的納米囊泡，它保留了沒病毒遺傳物質的融合蛋白，因此與病毒載體相比，免疫原性較低。然而傳統的病毒體制備過程很繁瑣，涉及洗滌劑溶解病毒膜蛋白，離心去除病毒核酸，最后進行脂質自組裝。此外，使用洗滌劑可能會破壞膜蛋白的結構和功能完整性，且脂質體自組裝過程無法確保藥物的有效封裝。Wang Y等人使用CFPS技術，在體外合成HA2蛋白，且在一步反應中制備HA2病毒體，并成功實現了siRNA的輸送。與Leci脂質體相比，HA2病毒體表現出更高的siRNA輸送效率和VEGF基因沉默效率。

圖3：病毒體的表達及運輸

上述應用場景只是CFPS技術在膜蛋白表達領域的冰山一角，它通過優化表達條件、簡化純化過程和提高穩定性，為解決膜蛋白表達和純化過程中的瓶頸問題提供了新的途徑。為膜蛋白的結構研究、功能驗證和藥物研發提供了有力支持。隨著技術的不斷進步和應用領域的拓展，CFPS技術有望在膜蛋白表達領域發揮更大的作用，為生物醫學研究和藥物開發做出更大的貢獻。

珀羅汀生物依托自主研發的無細胞蛋白表達平臺，已成功實現對膜蛋白的高效快速合成，成為膜蛋白表達的救星。

參考文獻

Guan L. The rapid developments of membrane protein structure biology over the last two decades. BMC Biol. 2023;21(1):300. Published 2023 Dec 29. doi:10.1186/s12915-023-01795-9.
方家豪,曹雨虹,何宇臻,洪戰英,柴逸峰.膜蛋白穩定技術及其在藥物篩選中的應用進展[J].藥學學報,2021,56(9):前插1-前插2,2325-2334.DOI:10.16438/j.0513-4870.2021-0573.
李劍勇,滿亞輝,陳倩,裴迪,吳文健.膜蛋白的表達：在無細胞體系中實現功能性表達、折疊和組裝[J].生物化學與生物物理進展,2018,45(4):389-400.
Wang Y, Jin B, Li B, et al. Cell-free protein synthesis of influenza virus hemagglutinin HA2-integrated virosomes for siRNA delivery. Int J Pharm.2022;623:121890. doi:10.1016/j.ijpharm.2022.121890.