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蛋白質的翻譯后修飾（Post-translational modification，PTM）極大地擴展了蛋白質組的多樣性，對蛋白質的生物學功能至關重要。常見的PTM類型包括磷酸化、糖基化、乙?；?、泛素化、甲基化等。
在進行PTM結構和功能研究時，通常需要獲得均一且在特定位點有修飾的蛋白，而這往往是該研究領域的難點。其原因有：
1. 許多在大規模篩選中發現的修飾，其體內進行修飾的天然酶是未知的。
2. 天然酶可操控性低，有些修飾酶的底物特異性較廣泛，無法在特定位點獲得所需的PTM而不影響其他位點；而有些修飾酶的底物特異性相對嚴格，無法在天然位點以外的位置進行PTM。
非天然氨基酸選擇性引入PTM
那么，能否不依賴天然酶直接合成具有所需PTM的蛋白質呢？通過在蛋白質中插入非天然氨基酸（nnAA或ncAA），即可實現將感興趣的PTM選擇性地引入目標蛋白質的任意位點。
圖1 通過遺傳密碼擴展在蛋白質中插入非天然氨基酸[1]
通過插入nnAA引入位點特異性PTM主要有三種方法：
①直接摻入包含目標修飾的 nnAA。目標蛋白質合成后，即具備所需的PTM。
②摻入包含掩蔽PTM的nnAA。翻譯后，可以用（光）化學方法去除掩蔽基團，所得蛋白質即可用于后續研究。
③摻入包含化學手柄的nnAA，該手柄可通過后續的生物共軛反應引入所需的PTM[1]。
圖2 通過插入各種非天然氨基酸引入PTM[1]
非天然氨基酸引入磷酸化修飾案例
磷酸化是磷酸基團與蛋白質的可逆連接，是自然界中最重要的翻譯后修飾（PTM）之一，是蛋白質功能和分子識別多樣化的機制。Javin等人[2]利用無細胞蛋白表達系統（CFPS），通過在特異位點引入磷酸化絲氨酸（Sep）成功表達了有活性的人類MEK1激酶，評估了單磷酸化和雙磷酸化形式的位點特異性磷酸化對MEK1活性的貢獻。
首先，研究人員利用來源于大腸桿菌的細胞提取物構建了無細胞表達系統（CFPS）。該大腸桿菌菌株為釋放因子1（RF1）與磷酸絲氨酸特異性磷酸酶（SerB）的缺陷型菌株，且生長過程中表達了磷酸絲氨酸的正交翻譯系統（Sep-OTS），因此所構建的CFPS體系富含磷蛋白合成所必需的OTS成分（即磷酸絲氨酸-tRNA合成酶、tRNASep和 EF-Sep）。
圖3 通過CFPS引入Sep合成磷蛋白[2]
隨后，研究人員利用該CFPS系統在20小時內表達了在S218和S222位置為絲氨酸的野生型MEK1（MEK1-SS）、在S218或S222處單位點磷酸化的MEK1變體（MEK1-SPS、MEK1-SSP）、以及雙磷酸化的MEK1變體（MEK1-SPSP）。成功表達不同形式的MEK1后，研究人員通過WB分析驗證了全長MEK1及各種變體的產生；通過Phos-Tag凝膠移位分析驗證了Sep的存在，并清楚地證明了MEK1的單位點和雙位點磷酸化。最后研究人員通過體外激酶級聯試驗探究了CFPS的單磷酸化和雙磷酸化MEK1變體對ERK2的酶活性。
圖4 磷酸化MEK1變體的體外合成[2]
該研究通過CFPS系統引入磷酸化表達MEK1之處在于：第一，CFPS系統規避了nnAA跨膜運輸，該研究中MEK1突變體表達量遠高于細胞內表達（0.001 mg/mL）[3]；第二，本研究通過CFPS系統可以在沒有融合伴侶的情況下表達MEK1，不產生可溶性蛋白伴侶的混雜影響。第三，通過在特異位點引入Sep能夠產生單磷酸化形式的激酶，而無需添加丙氨酸突變來抑制第二位點的磷酸化。
CFPS的非天然氨基酸插入天賦
無細胞蛋白表達（CFPS）是將細胞內合成蛋白所需要的RNA聚合酶、核糖體及轉錄翻譯輔助因子等分子機器提取出來，并輔以核苷酸、氨基酸、能量物質及基因模板而在沒有活細胞參與的體外直接合成蛋白質的生物反應。
CFPS在非天然氨基酸插入領域具有顯著優勢：
（1）無細胞系統沒有細胞膜阻礙，規避了nnAAs跨膜運輸的難點；
（2）無細胞系統不受nnAAs以及目標非天然蛋白可能產生的細胞毒性作用影響；
（3）有利于消除nnAAs插入的內源性競爭，提高nnAAs插入效率。
參考文獻：
[1]NIU W, GUO J. Co-translational Installation of Posttranslational Modifications by Non-canonical Amino Acid Mutagenesis. ChemBioChem, 2023, 24(9).
[2]OZA J P, AERNI H R, PIRMAN N L, 等. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications, 2015, 6.
[3]Park, H.-S., 等. Expanding the genetic code of Escherichia coli with phosphoserine. Science, 2011, 333.
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