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無細(xì)胞蛋白表達(dá)：突破傳統(tǒng)瓶頸的新興技術(shù)

更新時(shí)間：2024-06-20 點(diǎn)擊次數(shù)：1574

蛋白質(zhì)是生命體最重要的分子之一，具有極其廣泛的功能和作用。傳統(tǒng)上，研究者可以利用細(xì)胞表達(dá)體系來制備需要的蛋白質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行深入的研究。然而，受限于細(xì)胞生長、維護(hù)、污染等因素，細(xì)胞表達(dá)體系面臨著一些瓶頸和挑戰(zhàn)，特別是在高通量生產(chǎn)和定制蛋白質(zhì)方面更是如此。

為了突破這些限制以及為高效蛋白質(zhì)制備和研究提供更多選擇，無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。它作為一種基礎(chǔ)研究工具已經(jīng)在生命科學(xué)中使用了五十多年，最近的技術(shù)發(fā)展促進(jìn)了無細(xì)胞蛋白表達(dá)的高產(chǎn)。與傳統(tǒng)的細(xì)胞表達(dá)體系不同，無細(xì)胞表達(dá)體系可以在體外條件下完成蛋白質(zhì)的合成，并且具有高效、便捷、靈活以及高純度等優(yōu)點(diǎn)。隨著技術(shù)的發(fā)展無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)正在成為生物醫(yī)藥和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中備受關(guān)注的新興技術(shù)之一。

圖1：無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展

今天，小編將從無細(xì)胞蛋白表達(dá)的概念、技術(shù)原理、關(guān)鍵技術(shù)細(xì)節(jié)等方面探討這一引人注目的技術(shù)。

一

概述

無細(xì)胞蛋白表達(dá)是一種體外重組蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)也稱為無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成技術(shù)（CFPS：Cell-free protein synthesis），是指用含有蛋白合成必需的組分（核糖體，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，氨酰合成酶，啟動(dòng)/延伸/終止因子，三磷酸鳥苷，ATP，Mg2+和K+）的細(xì)胞裂解物在體外進(jìn)行蛋白合成。

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)適用于制備各種類型的蛋白質(zhì)，包括難表達(dá)蛋白質(zhì)、毒性蛋白質(zhì)、復(fù)雜蛋白質(zhì)等。在藥物研究、生物制造和生命科學(xué)等領(lǐng)域中得到廣泛關(guān)注和應(yīng)用，無論是研究、開發(fā)還是商業(yè)化應(yīng)用過程。目前無細(xì)胞蛋白表達(dá)主要應(yīng)用于藥物研發(fā)領(lǐng)域，例如抗體制備和生物藥物生產(chǎn)等。隨著人工智能技術(shù)的不斷發(fā)展，無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)可以與人工智能算法結(jié)合，構(gòu)建計(jì)算機(jī)輔助的高通量生產(chǎn)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化、精準(zhǔn)的生物醫(yī)學(xué)治療。除此之外，還能夠應(yīng)用于其他領(lǐng)域，例如基因工程、環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等。隨著無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的不斷發(fā)展和人工智能技術(shù)的不斷進(jìn)步，我們可以看到更多的新領(lǐng)域和新應(yīng)用出現(xiàn)，給生物科技行業(yè)帶來更多的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

圖2：典型無細(xì)胞蛋白表達(dá)的工作流程

二

技術(shù)原理

CFPS系統(tǒng)使用微生物、植物或動(dòng)物的粗細(xì)胞裂解物中的成分來合成蛋白質(zhì)。常用的粗提取物是大腸桿菌、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、小麥胚芽（WGE）、昆蟲細(xì)胞或市售的純化重組元件系統(tǒng)（PURE）。CFPS系統(tǒng)的制備是一個(gè)簡單的過程，其中目的細(xì)胞過夜生長，稀釋，并進(jìn)一步生長，直到光密度達(dá)到0.8至1.0，之后收獲細(xì)胞并超聲處理以提取細(xì)胞裂解物。然后將添加了必要輔因子、能量源、核苷酸、底物、氨基酸和tRNA的緩沖混合物添加到細(xì)胞提取物中，將其轉(zhuǎn)化為CFPS和無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄-翻譯（TX–TL）系統(tǒng)。

CFPS系統(tǒng)的一般方案如圖3所示，該實(shí)驗(yàn)使用含有必要細(xì)胞裂解物和DNA（線性或質(zhì)粒）的緩沖液，以及相關(guān)的能量源、核苷酸、氨基酸、鹽和輔因子，共同維持反應(yīng)以合成感興趣的產(chǎn)物。CFPS的合成產(chǎn)物可能因多種化學(xué)或生物部分而異，包括病毒、治療劑、抗體、化學(xué)品、生物燃料和蛋白質(zhì)。在合成此類產(chǎn)物時(shí)，CFPS系統(tǒng)相對(duì)于體內(nèi)系統(tǒng)具有直接優(yōu)勢，特別是考慮到該技術(shù)的相對(duì)速度、簡單性和有效性。通常，體內(nèi)系統(tǒng)是耗時(shí)的，并且往往比CFPS系統(tǒng)有更多的步驟。

圖3：在單管中進(jìn)行的CFPS系統(tǒng)的示意圖

三

技術(shù)細(xì)節(jié)

反應(yīng)體系

反應(yīng)體系的搭建是無細(xì)胞蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，為保證反應(yīng)的高效性和可重復(fù)性，需要精心構(gòu)建反應(yīng)體系，包括選用合適的模板、化學(xué)物質(zhì)、電解質(zhì)、抗氧化劑和各種工具等。

反應(yīng)條件

需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整反應(yīng)條件，包括溫度、離子強(qiáng)度、pH、反應(yīng)時(shí)間等多個(gè)方面，有利于促進(jìn)核苷酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯，以及蛋白質(zhì)的自組裝和成型。

生產(chǎn)規(guī)模

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)可以擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，提高生產(chǎn)效率，但需要保證反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，同時(shí)要保證反應(yīng)環(huán)境的清潔和消毒，以避免其他污染物的進(jìn)入，從而影響蛋白質(zhì)的純度和活性。

四

技術(shù)優(yōu)勢

更高的蛋白質(zhì)表達(dá)量

傳統(tǒng)的活細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)受限于細(xì)胞本身的多方面因素，其表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量往往受到限制。而無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)通過在體外底物濃度高的環(huán)境中進(jìn)行合成反應(yīng)，不但避免了傳統(tǒng)活細(xì)胞表達(dá)所面臨的方方面面的限制，還能夠很好地控制反應(yīng)體系，從而獲得表達(dá)量更高的蛋白質(zhì)。

更快的表達(dá)速度

傳統(tǒng)活細(xì)胞蛋白表達(dá)需要細(xì)胞生長并達(dá)到最佳密度時(shí)才能進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，這個(gè)過程往往需要數(shù)天時(shí)間。而無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)通常只需要數(shù)小時(shí)就能夠完成蛋白質(zhì)的表達(dá)，這個(gè)速度明顯快于傳統(tǒng)活細(xì)胞表達(dá)技術(shù)。

更精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)合成

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在體外進(jìn)行蛋白質(zhì)合成，能夠精確控制底物濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)劑比例等參數(shù)，因此可以更加精準(zhǔn)地合成定制的蛋白質(zhì)，這對(duì)于研究和應(yīng)用來講具有重要意義。

更靈活控制

在無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)中，可以使用分離的組分體系進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成，可以控制底物和反應(yīng)劑的比例，也可以在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下進(jìn)行自定義的修飾，如蛋白質(zhì)標(biāo)記、藥效分析等。這些優(yōu)點(diǎn)使得無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)更加靈活、可控，適用于更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。

圖4：體內(nèi)細(xì)胞和體外無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成比較

五

應(yīng)用

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)是一種飛速發(fā)展的新型生物技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景和潛力。該技術(shù)可以快速、高效、經(jīng)濟(jì)地合成蛋白質(zhì)，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、制藥、農(nóng)業(yè)、生物材料等多個(gè)領(lǐng)域。

醫(yī)療領(lǐng)域

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，可以用于生產(chǎn)多種蛋白質(zhì)藥品，如單克隆抗體等。其中，單克隆抗體是一種重要的治療藥物，具有高度特異性和親和力，可用于腫瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病等疾病的治療。傳統(tǒng)單克隆抗體生產(chǎn)方法需要花費(fèi)大量時(shí)間和成本，而無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)則可以在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模合成單克隆抗體，從而大大縮短生產(chǎn)周期，并且可以降低成本。此外，無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)也可以用于疫苗研發(fā)。比如瘧疾疫苗研究開發(fā)昂貴又耗時(shí)，目前利用WGE系統(tǒng)可加速疫苗研發(fā)，并建立高通量瘧原蟲抗體篩查系統(tǒng)。Stark等利用大腸桿菌的便攜式凍干裂解物再水化，1h內(nèi)合成高致病性病原體土拉弗朗西斯菌亞種的生物偶聯(lián)疫苗，與工程菌生產(chǎn)的疫苗相比，其可引發(fā)更高水平的病原體特異性抗體。

制藥領(lǐng)域

制藥領(lǐng)域是無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的一個(gè)重要應(yīng)用領(lǐng)域。藥物開發(fā)的成功率取決于藥物分子對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力，而目標(biāo)蛋白對(duì)于專一的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和分類的組織或器官非常敏感。通過無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，研究人員可以在不依賴于細(xì)胞的情況下直接生產(chǎn)大量需要的蛋白質(zhì)，為藥物研發(fā)提供了更快更便捷的方法。

基礎(chǔ)研究領(lǐng)域

利用無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)可以直接對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行核磁共振分析，目前已確定了數(shù)千個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。可以通過合成蛋白質(zhì)建立蛋白質(zhì)陣列，解開基因產(chǎn)物的功能；應(yīng)用核糖體展示和 mRNA 展示技術(shù)，更有利于實(shí)現(xiàn)高通量篩選，全面深入研究基因特征和功能。通過無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大型蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和分析，同時(shí)也為基礎(chǔ)研究打開了新的研究領(lǐng)域。

六

AI賦能無細(xì)胞蛋白表達(dá)

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)以及基于機(jī)器學(xué)習(xí)的人工智能技術(shù)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用也日益成熟和廣泛。同時(shí)，由于無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的新型性和高效性，使得該技術(shù)與人工智能技術(shù)的結(jié)合也更加有前景。當(dāng)前，人工智能正在被廣泛應(yīng)用于科學(xué)和醫(yī)療領(lǐng)域。在無細(xì)胞蛋白表達(dá)研究方面，人工智能已被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析和解釋結(jié)果。

一方面，人工智能技術(shù)可以為無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的高效應(yīng)用提供支持。在無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)中，蛋白質(zhì)合成是一個(gè)十分關(guān)鍵和繁瑣的過程，需要進(jìn)行多層面調(diào)控和優(yōu)化。而人工智能技術(shù)則可以利用算法分析數(shù)據(jù)，預(yù)測蛋白質(zhì)表達(dá)的最佳參數(shù)，并實(shí)現(xiàn)高通量的蛋白質(zhì)表達(dá)。例如，一些研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種利用深度學(xué)習(xí)預(yù)測無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的算法，可以預(yù)測蛋白質(zhì)表達(dá)的最佳條件并改善合成效率。

另一方面，無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)和人工智能技術(shù)的結(jié)合也可以拓展生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。例如，利用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)和人工智能技術(shù)可以快速高效地生產(chǎn)一些生物標(biāo)志物或特定蛋白質(zhì)，用于生物檢測和診斷。同時(shí)，人工智能技術(shù)可以根據(jù)病態(tài)組織特異性標(biāo)識(shí)，利用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)高效合成具有特定作用的生物藥劑，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)性化治療，具有廣闊的研究和應(yīng)用前景。

七

展望

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)是一項(xiàng)革命性的技術(shù)，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。通過不斷的探索和研究，相信這一技術(shù)將在醫(yī)療、制藥、農(nóng)業(yè)、科學(xué)等領(lǐng)域中發(fā)揮越來越重要的作用，為人類生產(chǎn)和生活帶來更多的可能性。未來，結(jié)合AI技術(shù)，無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)有望繼續(xù)創(chuàng)新和發(fā)展，成為生命科學(xué)在全球范圍內(nèi)最為重要的技術(shù)之一。

圖5：無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的展望

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