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開篇語
在生物技術的廣闊領域中，無細胞表達系統正逐漸嶄露頭角，成為推動技術創新的重要平臺。它不受限于活細胞環境的復雜性，能夠實現高效、可控的生物化學反應，從而極大地促進了新藥物、新材料的研發進程。
今天小編和大家分享一篇發表于Life-basel上的一篇名為“Biotechnology Applications of Cell-Free Expression Systems"的文獻。該篇文獻綜述了無細胞表達系統（CFES）在生物技術中的廣泛應用，并且特別關注了無細胞蛋白合成（CFPS）的新興應用。此外，本文還探討了機器學習在優化CFPS中的應用。
一、研究背景
傳統上，體內表達平臺被用來合成新的與工業相關的蛋白質，并作為基因回路和生物傳感器等許多生物技術原型的測試臺，但它們受到生長周期的時間限制、穩態考慮因素和生產適應性有限的阻礙。相反，無細胞平臺不受支持生命的約束的阻礙，相比傳統的體內系統，無細胞平臺不受生命維持條件限制，展現出更高的適應性和靈活性，適用于多種生產和檢測場景，因此高度適應廣泛的生產和測試計劃。未來十年，無細胞技術應用預計將迎來爆發式增長，特別是在無細胞蛋白合成方面，將深入探索其在代謝工程、原型設計及生物制造中的應用，并結合機器學習以優化這些過程。簡言之，無細胞系統正革新生物技術領域，成為解決現有技術局限性的有力工具。
二、生物技術的應用
1.無細胞代謝工程（CFME）
代謝工程是操縱細胞的遺傳和分子過程，以獲得對生物功能的洞察力和控制，如酶通路、信號轉導和基因表達。自該領域成立以來，一直是利用無細胞系統來進行研究。通過無細胞系統，研究者可以快速原型化新的代謝途徑，評估不同代謝酶的性能，優化代謝途徑。CFME在無需活細胞支持的情況下，可以方便地調整代謝條件，模擬不同的環境條件，為代謝工程研究提供強有力的支持。最近，無細胞系統代謝工程的新進展促進了裂解物的進一步優化和對酶通路的更大控制。西北大學的Jewett實驗室已經證明了酶在裂解之前的過度表達，以及隨后在單個裂解物中過度表達的酶的混合。開放式操作允許在基于裂解液的無細胞系統中進行更大程度的定制，允許更廣泛的表達范圍，并能夠通過CFPS控制整個通路。此外，無細胞系統表現出的擴大生產規模、控制反應因子和通過代謝調控產生各種目標蛋白的能力，表明CFPS和CFME比細胞系統更具有優勢。
2.無細胞系統原型設計
原型設計是一個實驗過程，其中測試了一個新的想法、工具或系統。在為大規模生產等工業應用優化生物和生化系統之前，這些系統必須首先在原型階段得到驗證。無細胞表達技術為生物技術原型制作提供了一個理想的平臺，可以快速合成和測試基因電路、生物傳感器等復雜生物系統，評估其性能，加快研發速度。其在原型空間中具有重要優勢，比如：
（1）縮短了時間尺度，基于細胞的系統需要幾天或可能幾周才能完成，無細胞系統則可以在幾小時內完成。
（2）增加了靈活性、可操作性，其開放的工作環境允許研究者實時觀察和分析生物合成過程，為原型制作的優化提供重要信息。
（3）使用線性DNA，傳統上進行遺傳電路原型制作是耗時的，每個周期需要幾天時間來驗證。而線性DNA可以在短短4-8小時內運行相同的循環，允許驗證大型遺傳回路，繞過體內驗證，并可能允許對以前被認為毒性太大而無法使用的分子進行新的研究。
3.無細胞生物傳感器
無細胞生物傳感器是一種利用無細胞系統（如細胞提取物）進行生物和化學信號檢測的技術。與傳統的基于細胞的生物傳感器相比，無細胞生物傳感器不受細胞膜內復雜環境的影響，具有低廉的成本、更高的可控性和優化潛力。該技術能夠克服傳統基于細胞的生物傳感系統的限制，如無法直接觀測生物分子相互作用、對細胞培養條件敏感、細胞膜內操作的困難等問題。
無細胞生物傳感器可以檢測多種分析物，且通過遺傳工程可進一步增強其檢測范圍和靈敏度。例如，轉錄因子和核糖開關等元件被用于無細胞系統中檢測特定目標分子，如病毒、病原體或毒素。不僅提供了更高的安全性和靈敏度，而且還適用于復雜或有毒環境中，無需擔心釋放遺傳改造生物體的潛在風險。此外，隨著檢測方法的創新，生物傳感器硬件的技術革命也擴大了其檢測能力和整體使用。在可穿戴技術市場上，這種創新較普遍。
4.無細胞生物制造
生物制造是通過生物、生化和化學合成平臺生產具有商業價值的化學品和材料的過程。生物制造行業價值的預計增長是向無細胞生產平臺過渡。與目前用于生物制造的基于細胞的系統相比，無細胞平臺具有許多優勢，比如不受生物體內穩態的限制、可操作性更強、生產周期短、效率高等。這些優勢表明，無細胞生物制造平臺代表了向生產藥品、食品和其他工業相關生物分子的更高效和更具成本效益的方向進步。
（1)制藥行業的應用
生產單克隆抗體：無細胞平臺能夠快速、高效地生產單克隆抗體，克服傳統細胞培養方法的局限，如周期長、資源消耗大等問題。
生產抗菌肽和疫苗：無細胞平臺可以有效生產抗菌肽和疫苗等生物活性物質。
小分子和膜蛋白：無細胞平臺可以表達難表達的蛋白包括小分子藥物和膜蛋白。
按需生產：無細胞平臺非常適合小批量和定制化的生物分子生產，能夠滿足特殊用途和個體化醫療的需求。
（2）食品生物技術的應用
無細胞平臺能夠模擬自然條件下的生物合成過程，高效生產天然食品成分，如營養素、功能性食品原料等，滿足市場對健康食品的需求。其優點允許生產比基于細胞的系統更大的潛在成分，包括益生菌、益生元、蛋白質、氨基酸、膳食纖維和維生素，并將降低生產這些成分或從天然來源中提取它們的成本和時間。
（3）生長行業和工業相關生物分子
除了制藥和食品行業，化妝品和工業生物分子生產等其他行業也可以從無細胞系統中受益。膠原蛋白及其衍生物在CFPS實驗中得到了很好的記錄，無細胞平臺可以優化生產用于化妝品應用的膠原蛋白。
5.無細胞系統中應用機器學習
機器學習（ML）是一種人工智能，它使用數據分析來改進各種不同應用程序的建模方法。較常用的機器學習方法包括人工神經網絡、集合學習、多變量統計分析和高斯過程。由機器學習算法優化的CFPS系統的第一個例子是與高通量實驗耦合的機器人工作站。這種方法對應于實驗的進化設計（Evo-DOE），是基于人工神經網絡（ANN）的機器學習算法，該算法預測下一輪實驗以改善適應性功能。另外，機器學習算法結合自動化工作站和高通量實驗，可以預測下一輪實驗的方向，從而提升蛋白質產量并改進系統的其他輸出。通過機器學習算法優化能量緩沖液中的組分濃度，可以顯著提高熒光報告蛋白的產量，并降低無細胞反應的成本。此外，它還能夠在短時間內探索龐大的實驗空間，并實現系統的顯著優化?？傊瑹o細胞表達系統正在走向工作流程標準化和自動化，通過基于機器學習算法，從而支持高效的系統設計。
圖2：涉及機器學習的設計-構建-測試-學習周期
三、總結
無細胞系統的高效、靈活與低成本特點使其在生物系統工程中的地位日益突出。通過這一系統，研究人員能深入洞察和控制生物分子過程，實時觀察并調整反應參數，實現高效的生物傳感和制造。同時，結合機器學習技術，無細胞系統的蛋白質產量和原型設計效率得以顯著提升。展望未來，無細胞表達系統在醫藥、生物制造等產業領域的應用前景廣闊，有望成為生物技術發展的關鍵方向。
參考文獻：
Brookwell, A., Oza, J. P., & Caschera, F. (2021). Biotechnology Applications of Cell-Free Expression Systems. Life (Basel, Switzerland), 11(12), 1367.
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